Pureza de péptidos por HPLC: cómo funciona cada técnica del análisis
· Novatheris
La pureza de péptidos por HPLC es el número que más se cita en un informe de laboratorio. Pero detrás de ese número hay una máquina, una columna, un detector y un software que toma decisiones. Saber cómo funciona ayuda a entender por qué el resultado dice lo que dice, y por qué no dice otras cosas.
Este artículo va por dentro de las técnicas: HPLC, espectrometría de masas, la prueba de endotoxinas y el análisis de metales. Si buscas qué significa el sello "+99.5 %" en sí, eso lo tratamos en qué significa +99.5 % de pureza.
Qué es HPLC
HPLC son las siglas en inglés de cromatografía líquida de alta resolución. La idea de fondo es separar una mezcla en sus componentes, uno por uno.
Para péptidos, lo más común es la modalidad de fase reversa. La columna es un tubo de acero relleno de partículas muy finas recubiertas de cadenas de carbono, muchas veces C18. Esa superficie es hidrofóbica: atrae a las partes de la molécula que "huyen" del agua.
La muestra disuelta entra a la columna empujada por un líquido, la fase móvil. Cada molécula se queda pegada a la superficie un tiempo distinto, según qué tan hidrofóbica sea. Las que se pegan menos salen primero, y las que se pegan más, después.
El gradiente y el tiempo de retención
La fase móvil no es fija. Típicamente es una mezcla de agua y acetonitrilo, a menudo con un poco de ácido trifluoroacético, y la proporción de acetonitrilo va subiendo durante la corrida. A eso se le llama gradiente.
Al subir el acetonitrilo, el líquido se vuelve más capaz de "despegar" moléculas de la columna, y van saliendo en orden. El momento en que sale cada compuesto se llama tiempo de retención.
Bajo las mismas condiciones, un compuesto sale siempre más o menos al mismo minuto. Por ejemplo, en el certificado de Freedom Diagnostics Testing NOVA2609150054, de Retatrutida 20 mg, el cromatograma impreso muestra un pico único cerca de los 15 minutos.
El detector y el cálculo del porcentaje
A la salida de la columna hay un detector de luz ultravioleta. Para péptidos se mide normalmente entre 210 y 220 nanómetros, porque ahí absorbe el enlace peptídico, el que une un aminoácido con el siguiente.
Cada vez que algo pasa por el detector, la señal sube y forma un pico. El gráfico completo, señal contra tiempo, es el cromatograma.
La pureza se calcula así: área del pico principal dividida entre el área de todos los picos, por cien. Si el principal se lleva el 99.678 % del área, como en nuestro informe Janoshik #123821 de Tirzepatida 30 mg, ese es el número.
Qué quiere decir +99.5 % en este cálculo
Dicho en términos de HPLC, "+99.5 %" quiere decir que el pico del péptido se lleva al menos el 99.5 % del área que el detector ve. Lo que queda, menos de medio punto, se reparte entre los picos chicos de impurezas.
Para nosotros es el estándar de marca para cada tanda. El número exacto de tu frasco está en el informe de su tanda, no en el sello.
Lo que el HPLC no puede ver
Aquí están los límites, y conviene conocerlos.
Lo que no absorbe a esa longitud de onda no cuenta. La sal y el agua que trae el polvo no aparecen en el cromatograma. Por eso la pureza es un porcentaje relativo, no el peso del frasco.
Dos compuestos pueden salir juntos. Si una impureza tiene casi la misma hidrofobicidad que el péptido, puede salir pegada al pico principal y sumarse a él. Un pico limpio no garantiza que debajo no haya otra cosa.
El software decide dónde empieza y termina cada pico. Esa integración depende de parámetros, y cambia de laboratorio a laboratorio. Por eso dos informes del mismo compuesto no dan el mismo decimal.
No dice qué compuesto es. El HPLC separa y cuantifica. No identifica.
Espectrometría de masas: la identidad
Para saber qué es el pico, se usa la espectrometría de masas, MS por sus siglas en inglés. Cuando va conectada al HPLC se llama LC-MS.
El principio es pesar moléculas. La muestra se ioniza, es decir, las moléculas reciben carga eléctrica. Para péptidos lo común es la ionización por electrospray. Una molécula grande suele cargar varias cargas a la vez, así que el equipo ve varias señales para el mismo péptido.
Lo que el instrumento mide es la relación entre masa y carga, que se escribe m/z. A partir de esas señales, el software reconstruye el peso molecular real. Ese peso se compara con el teórico.
Un ejemplo de referencia: según PubChem, la Tirzepatida pesa 4813.53 Da y la Retatrutida 4730.477 Da. Si el pico pesa lo que debería, la identidad está confirmada. Si pesa otra cosa, no importa qué tan limpio se vea.
El certificado NOVA2609150054 declara como método "HPLC with UV detection coupled with mass spectrometry (LC-MS)" e imprime la confirmación de masa junto al cromatograma.
Endotoxinas: la prueba LAL
Las endotoxinas son restos de la pared de bacterias gram negativas. Un péptido puede ser purísimo por HPLC y aun así traerlas, porque son cosas que el HPLC no busca.
Se miden con la prueba LAL, que usa un extracto de células de la sangre del cangrejo herradura. Ese extracto reacciona ante las endotoxinas con una cascada de coagulación. El capítulo de referencia es el USP 85.
Hay tres formas principales de leer esa reacción:
- Gel clot: se ve si se forma un gel firme o no. Es una prueba de sí o no por encima de un umbral.
- Turbidimétrica: se mide cuánto se enturbia la mezcla con el tiempo.
- Cromogénica: la reacción libera un color, y se mide su intensidad.
El resultado va en EU, unidades de endotoxina. Nuestro informe Janoshik #123822 reporta menos de 1 EU por frasco.
Metales pesados
El análisis de metales busca elementos tóxicos que pudieron entrar en la fabricación. La guía de referencia internacional es la ICH Q3D(R2), y sus metales de Clase 1 son cadmio, plomo, arsénico y mercurio.
La técnica habitual en la industria para esto es la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, ICP-MS. La muestra se lleva a un plasma muy caliente que rompe todo en átomos, y el equipo cuenta los átomos de cada elemento por su masa. Detecta cantidades muy pequeñas.
Nuestro informe Janoshik #123823 reporta arsénico, cadmio y plomo como "not detected", y mercurio también, en el campo de comentarios. No detectado quiere decir por debajo del límite del método, no cero.
Cuatro técnicas, cuatro preguntas
- HPLC-UV: ¿qué tan limpio está el péptido frente a lo que el detector ve?
- MS: ¿es el compuesto que dice ser?
- LAL: ¿cuántos restos de bacterias trae?
- ICP-MS u otro método de metales: ¿hay metales tóxicos?
Ninguna responde la pregunta de otra. Por eso un informe serio no se queda en un solo número.
Puedes ver los informes de pureza, identidad, endotoxinas y metales de cada tanda analizada, tal cual los entrega el laboratorio, en la sección de análisis de laboratorio. El de Retatrutida, con sus cuatro informes de Janoshik y Freedom, está en análisis de Retatrutida.